人骨肉瘤细胞HOS培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人骨肉瘤细胞HOS

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% NEAA + 1% P/S

传代方法：第一次建议1:2传代

传代情况：2天换液

备注：建议使用无菌离心管收集培养基，以便进行过渡性对比培养。如对比培养效果不理想，建议直接购买我们的918博天堂完全培养基。

二、细胞收到后处理

收到细胞后，在细胞培养状态良好时，灌满完全培养液并封好瓶口，以确保其运输过程中的稳定性。

收到细胞时，需使用75%酒精对细胞瓶进行消毒，然后放置于超净工作台中进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定后再进行操作。

用显微镜观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片用于保存（推荐40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，不提供照片则默认收到状态良好。（传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基，以进行对比培养，换液后请将瓶盖稍微松开。）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，将瓶中的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱中继续培养；如细胞密度超过80%，可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后观察细胞消化状态。如大部分细胞变圆并脱落，请迅速取回，轻轻敲击培养瓶后添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，添加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长达到覆盖培养瓶80%的面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS洗涤细胞一次；
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，再轻轻吹打以使细胞脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的918博天堂无血清冻存液，混匀后转移至冻存管中；
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中保存，如后期需要转移至液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无冰晶存在，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁；
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟；
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能因为贴壁不牢而脱落，这是正常现象。如脱落较多，可以将培养瓶中的所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期对比培养）。沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打以进行重悬，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基终止反应。再离心、弃去上清，添加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题时可重发的情况及判定标准

1. 如细胞在运输途中遭遇问题（如细胞丢失、瓶破损、培养液严重漏液等），即可申请重发；
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后可重发；
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰运输的细胞在复苏后24小时内未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可重发；
4. 若干冰发货细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时，未开封即出现污染，亦可重发；
5. 如细胞活性存在问题，请在收到产品7天内提供真实实验结果，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发；
6. 收到细胞当天及第2、3天内请拍照，如未在3天内告知，将视为产品合格。若在4-7天内出现问题，需要提供收到细胞前3天的照片及详细操作步骤，与技术人员沟通后如判定为我方责任，则可重发。

2）细胞出现问题时不予重发的情况

1. 客户造成的细胞污染，不予重发；
2. 客户操作不当导致细胞状态不良，不予重发；
3. 非本库推荐的培养体系导致细胞状态不良，不予重发；
4. 细胞状态不良而未提供前三天照片，不予重发；
5. 处理过细胞后，不予重发；
6. 在收到细胞2天内未告知的不予重发；
7. 具体情况视情况而定。

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